Pewarnaan Gram

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.  Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.  Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur biakan. 

Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.  Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.  Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.  Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif.  Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :

1.       Teori Salton

Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif.  Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol.  Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol.  Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.

2.       Teori permeabilitas dinding sel

Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel.  Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan.  Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak.  Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

Prinsip dasar pewarnaan gram  ini adalah :

1.       Mewarnai bakteri dengan pewarnaan dasar, yaitu kristal violet

2.       Menguatkan pelekatan zat pewarna dengan garam Iodin.

3.       Melunturkan warna dasar dengan alkohol.

4.       Pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding (counter stain) yaitu Safranin.

Bakteri yang terwarnai oleh kristal violet dan tidak luntur dengan pemberian alkohol, akan berwarna ungu  dan disebut bakteri Gram positif, sedangkan bakteri yang telah terwarna oleh kristal violet namun luntur pada saat diberi alkohol, akan terwarnai merah oleh pewarna pembanding (safranin)  dan disebut bakteri Gram negatif. Warna ungu pada bakteri Gram positif terjadi akibat pembentukan senyawa kompleks kristal violet-lugol yang tidak larut dengan alkohol.

Pengecatan Gram memerlukan mikroba dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10⁴ per ml.  Sampel yang cair dengan jumlah kecil, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroba tersebut.  Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis

Persiapan sediaan apusan (Pembuatan Preparat)

Pada umumnya sebelum bakteri diwarnai perlu dilakukan fiksasi atau dibuat sediaan atau preparat (smear)  terlebih dulu. Fungsi fiksasi antara lain untuk membunuh bakteri secara cepat dengan relatif tidak menyebabkan perubahan bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas kaca obyek, dan meningkatkan sifat afinitas pewarna. Cara fiksasi yang paling sering dilakukan dalam pewarnaan bakteri adalah secara fisik dengan pemanasan. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

Tujuan  :                              Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan (preparat)

Alat dan bahan :                Bahan biakan (koloni mikroba) yang akan dibuat preparat. Biakan murni bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus,  Pseudomonas putida dan Bacillus subtilis

dalam media Nutrien Agar dan Nutrien cair umur 24 jam.

Oose atau kapas lidi steril dan kertas tissue

                                                Gelas obyek,  gelas penutup, lampu bunsen/lampu spiritus, alkohol 70 %,          

Cara kerja :

Teknik pembuatan apusan tergantung asal bahan biakan. Setiap jenia bahan, tehnik pembuatan apusan sedikit berbeda.

a.  Sumber biakan koloni mikroba langsung dari sampel.

Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin.  Gelas obyek dan gelas penutup sebelumnya dibersihkan dengan alkohol 70 % sampai gelas bebas dari lemak Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering.  Setelah kering, jika diperlukan teteskan dengan formalin 1 % dan selanjutnya tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi.  Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.

 b.  Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan membersihkan dengan alkohol selanjutnya dipanaskan di atas nyala api spiritus.  Ambil biakan cair (yang sebelumnya telah dihomogenkan) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan atau ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

c.  Bahan dari media pertumbuhan padat

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus.  Teteskan satu ose kaldu atau larutan garfis atau air steril pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni biakan dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan.  Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat a atau b. 

                 

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

• Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
• Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
• Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
• Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.